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上海IgM纯化

时间:2021-2-2 3:00:00  来源:http://sh.saiboerbio.com/news554715.html

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IgM纯化

绝大多数IgM类抗体是优血蛋白不融解水,故可用双蒸水剖析纯化IgM。对这种融解水的IgM类抗体可用饱和硫酸铵沉淀。沉定后可以采用顆粒抵触层析法(凝胶过虑)进一步纯化。


顆粒抵触层析(size-exclusion chromatography)法又称作碳分子筛层析或凝胶过虑,是应用微孔板凝胶获得不一样型号规格化学方程式的抗体,能用以样品中IgG和IgM的获得,多见于对硫酸铵粗提物的进一步纯化。依据该法纯化个税抗体能用以Ig化学方程式精彩画面的制得、FITC、生物素或同位素标记。


一、IgM纯化原料和试剂


1. 抗血清,杂交瘤肝硬化腹水或其上清,硫酸铵沉淀粗提γ血蛋白。


2. 含0.02%NaN3 的硼酸缓冲溶液,PBS。


3. 透析袋;26mm×900Mm层析柱。


4. 适当圆洞筛的顆粒抵触(SE)凝胶(AcA Ultragel-或Sephacryl S-200(Pharmacia LKB)。


5. 蛋白剖析、SE层析和SDS-PAGE尽量的其他试剂和器材。


二、IgM纯化操作步骤


1. 待获得 样品11,000~13,000r/min(15,000~20,000×g),4℃或室温旋蒸,除沉定。


2. 上清液对双蒸水剖析4℃24小时。


3. 11,000~15,000r/min 4℃ 或室温旋蒸2h,留沉定。


4. 制得SE凝胶层析柱,以硼酸缓冲溶液平衡。


5. 将步骤3沉定或饱和硫酸铵粗提γ血蛋白以3~5ml硼酸缓冲溶液溶化,缓慢移液。


6. 以硼酸缓冲溶液过柱蛋白质,并收集100管(每管为柱床容量的1%),IgM在过柱液的第一个蛋白峰。


7. 收集Ig蛋白峰,分别合并,剖析浓缩,紫外光分光光度计OD 280nm精确精确测量Ig成份,SDS-PAGE鉴定IgM纯度。


8. 以1~50mg Ig/ml硼酸缓冲溶液置4℃或-70℃存储。


凝胶以硼酸缓冲溶液持续消除后,再加上0.02%NaN3 置4℃存储可再一次运用。


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